Biogeneza i funkcja cząsteczek pochodzących z tRNA Arabidopsis thaliana

Abstract

Celem niniejszej pracy jest identyfikacja cząsteczek tRF Arabidopsis thaliana, stworzenie bazy danych tych fragmentów oraz rozpoznanie enzymów i czynników odpowiadających za ich powstawanie, wraz z przewidywaniem sekwencji docelowych. Analizy zostały przeprowadzone na własnych i publicznie dostępnych próbach z sekwencjonowania małych RNA (sRNA-Seq) w mutantach szlaków biogenezy i dojrzewania różnych niskocząsteczkowych RNA i tRNA oraz abiotycznych stresach A. thaliana. Analizy oparto o własne metody obliczeniowe napisane w językach programowania Python i R, wraz z wykorzystaniem dostępnych narzędzi bioinformatycznych. W ich wyniku zidentyfikowano sekwencje tRF z trzystu prób rzodkiewnika pospolitego. Uzyskane fragmenty zdeponowano w publicznie dostępnej bazie danych tRex (www.combio.pl/trex) wyposażonej w narzędzia do badania cząsteczek w kontekście struktury i przewidywanych modyfikacji tRNA oraz potencjalnych sekwencji, z którymi fragment może oddziaływać. Ponadto, scharakteryzowano grupy enzymów zaangażowanych w biogenezę sekwencji tRF, zwłaszcza rolę białek RNS2, HYL1 oraz DCL2/RDR6/RDR3b. Jednocześnie wykazano prawdopodobny udział modyfikacji i struktury drugorzędowej tRNA w powstawaniu cząsteczek tRF. Dodatkowo sprawdzono wpływ zmiennych warunków środowiskowych i pokazano, iż nadmierne zasolenie oraz susza wywołują znaczące różnice w poziomie badanych sekwencji. The aims of this PhD thesis encompass: identification of tRNA-derived fragments in Arabidopsis thaliana, development of a database of said sequences, as well as characterization of their biogenesis and functional potential. Methods used in this work include development of own pipelines, utilizing open-source bioinformatic tools as well as in-house Python and R scripts. In this work, I analyzed 300 in-house and publicly available small RNA-Seq libraries and deposited identified tRF sequences in the tRex database available at www.combio.pl/trex, which is outfitted with tools for tRF biology exploration in different genotypes and environmental conditions. I also included predictions of tRF modifications, as well as their target sequences among transposable elements and protein coding genes. Furthermore, I shed light on pathways involved in biogenesis of tRNA-derived fragments in A. thaliana, implicating possibly conserved roles of RNS2, DCL2/RDR6/RDR3b and HYL1 proteins, and recalled putative involvement of tRNA modifications and secondary structure in generation of small RNAs. Finally, I analyzed tRFs’ response to shifting environmental conditions, finding that high salinity and drought elicit majority of significant changes, and substantially expanding the repertoire of known, stress- esponsive tRNA-derived fragments.